MTNA︱姚远团队开发高效率、低脱靶的新型精腺嘌呤碱基编辑器

撰文︱李  果，姚  远责编︱方以一，王思珍编辑︱杨彬薇

近年来，CRISPR-Cas基因编辑技术的出现，对经济社会发展产生了重大影响。生命科学的研究已经从“基因组时代”向“基因组编辑时代”迈进。碱基编辑技术是基于CRISPR-Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术，目前依据碱基修饰酶的不同可分为胞嘧啶碱基编辑器 (Cytosine base editor, CBE) 和腺嘌呤碱基编辑器 (Adenine base editor, ABE)。碱基编辑技术因其高效、不依赖DNA双链断裂产生、无需供体DNA参与等优势，已经成功应用于各种动物、植物及其他生物中，为基因治疗及精准动植物育种等领域提供了重要技术支撑。

2017年，David Liu研究团队通过定向进化和蛋白质工程化改造技术对来自大肠杆菌的脱氨酶TadA进行改造，开发了四种腺嘌呤碱基编辑器：ABE7.10, ABE 6.3, ABE 7.8和ABE 7.9 [1]。2020年，David Liu与Jennifer A Doudna合作[2]通过噬菌体辅助持续进化技术开发了新型腺嘌呤碱基编辑器，ABE8e[3]。但这些编辑器仍然存在比较窗口较宽、脱靶率较高，无法实现精确编辑的问题。

2022年12月7日，浙江大学杭州国际科创中心生物与分子智造研究院姚远研究员课题组在Molecular Therapy-Nucleic Acids期刊在线发表了题为“A novel base editor SpRY-ABE8e^F148A mediates efficient A-to-G base editing with a reduced off-target effect”的研究论文。该研究发现在TadA8e脱氨酶中引入一个关键位点的氨基酸突变 (F148A)，构建的新型碱基编辑器SpRY-ABE8e^F148A在HEK293T, Hela等细胞中展现出极高的编辑效率，无PAM的限制，扩大了基因组的编辑范围，缩小了编辑窗口以及降低了脱靶编辑效率。SpRY-ABE8e^F148A是一款兼具高效率与低脱靶率的碱基编辑工具，有望提高未来临床应用的安全性。

本研究将脱氨酶TadA8e的48位的Phe突变为Ala氨基酸，构建了基于nSpRY-Cas9的新型碱基编辑器，SpRY-ABE8e^F148A。通过构建具有NAN, NCN, NGN, and NTN PAMs的内源编辑的sgRNA表达载体，在HEK293T与Hela细胞中，验证新碱基编辑器的编辑性能。实验结果显示，SpRY-ABE8e^F148A几乎可以靶向几乎所有PAM，在绝大多数位点中都展现出较高的编辑效率。相较于前期报道的SpRY-ABE8e编辑器，SpRY-ABE8e^F148A编辑效率更高且具有更窄的编辑窗口，提高了编辑的精确性，是一款更加精确的DNA单碱基编辑工具 (图1)。

图1 SpRY-ABE8e^F148A在人类细胞中的单碱基编辑效率结果图

（图源：Li G, et al., Mol Ther Nucleic Acids, 2022）

同时，高通量RNA-Seq的数据分析结果显示，相较于SpRY-ABE8e编辑器，SpRY-ABE8e^F148A显著降低了A > G脱靶编辑效率，减少了脱靶效应。SpRY-ABE8e^F148A在单碱基致病位点修复的应用研究中也展现出了其优势，本研究成功将SpRY-ABE8e^F148A应用于APOC3(D65N), SCN9A (R896Q) 与SLC30A8 (M50I) 等疾病细胞模型的精确修复。最后，本研究针对ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/, accessed February 2022).数据库中的G•C-to-A•T型疾病位点，开发了基于SpRY-ABE8e^F148A编辑器的sgRNA设计网站ARDPM (http://47.92.172.28:12026/)。

图2 SpRY-ABE8e^F148A的脱靶分析结果图

（图源：Li G, et al., Mol Ther Nucleic Acids, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

本研究对ABE碱基编辑器中的脱氨酶TadA8e进行了工程化处理，通过引入关键氨基酸位点的突变，构建了一款兼具高效性与高精确性的碱基编辑器，SpRY-ABE8e^F148A。SpRY-ABE8e^F148A在人源细胞中可实现G•C-to-A•T型致病位点的精确修复，且可靶向基因组的任何范围。但目前该编辑器仍存在脱靶效应未完全去除，个别位点的编辑效率偏低等局限，未来的方向仍然是通过PACE (Phage-assisted continuous evolution) 或计算机辅助蛋白进化 (Artificial Intelligence- driven, AI-driven) 等方式，对碱基编辑器中的核心蛋白进行功能的定向进化，改善旁系编辑、编辑的普适性等问题。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2162253122003183?via%3Dihub

第一作者：李果（左），程亚仙（中）；通讯作者：姚远（右）

（照片提供自：姚远团队）

作者简介（上下滑动阅读）

第一作者：

李果，2021年博士毕业于中国农业大学生物学院，2021年至今于浙江大学杭州国际科创中心姚远课题组从事博士后研究工作；以第一或共同第一作者在Signal Transduction and Targeted Therapy，Molecular Therapy- Nucleic Acids，Journal of Molecular Cell Biology等学术期刊发表论文5篇。

程亚仙，2021年博士毕业于浙江大学生命科学学院，2021年至今于浙江大学杭州国际科创中心姚远课题组从事博士后研究工作；以第一或共同第一作者在PNAS，Molecular Therapy- Nucleic Acids等学术期刊发表论文2篇。

通讯作者：

姚远，浙江大学杭州国际科创中心合成生物学研究所副所长，浙江大学杭州国际科创中心“百人计划”研究员PI，浙江大学化学工程与生物工程学院研究员（兼），浙江省杭州市高层次人才。在Chemical Reviews, Science, Advanced Functional Materials, Nature Communications, Nano Research, Molecular Therapy- Nucleic Acids等学术期刊发表论文40余篇，主持军科委，国家自然基金委，企业横向等各类科研项目10余项，主要从事基于数据驱动的合成生物学以及生物材料相关技术的研究。课题组目前成员12人，其中博士后5人。

网页介绍：https://hic.zju.edu.cn/ibct/2021/0903/c65939a2508011/page.htm

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Gaudelli NM, Lam DK, Rees HA, Solá-Esteves NM, Barrera LA, Born DA, Edwards A, Gehrke JM, Lee SJ, Liquori AJ, Murray R, Packer MS, Rinaldi C, Slaymaker IM, Yen J, Young LE, Ciaramella G. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nat Biotechnol. 2020. 38(7): 892-900.

[2] Richter MF, Zhao KT, Eton E, Lapinaite A, Newby GA, Thuronyi BW, Wilson C, Koblan LW, Zeng J, Bauer DE, Doudna JA, Liu DR. Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity. Nat Biotechnol. 2020. 38(7): 883-891.

[3] Li G, Cheng Y, Li Y, Ma H, Pu Z, Li S, Zhao Y, Huang X, Yao Y. A novel base editor SpRY-ABE8eF148A mediates efficient A-to-G base editing with a reduced off-target effect. Mol Ther Nucleic Acids. 2022. 31:78-87.

本文完